柳杉精油化學成分及其對對黑胸白蟻的毒殺活（huó）性研究

作（zuò）者：

謝永堅

摘要：

我國每年因白蟻危害造成的（de）經濟（jì）損失超過30億元（yuán）。目前,國（guó）內外白蟻預防和防治仍然以化學殺蟲劑為主,由於（yú）有機磷和有機氯殺白蟻（yǐ）劑的禁用,尋求新的防治白蟻技術和方法（fǎ）顯得十分必要。利用精油或（huò）精油中的活性（xìng）物質（zhì）防治白蟻是目前白蟻防治領域的（de）研究熱點之一。柳杉作為我（wǒ）國（guó）本土的、分布廣泛的豐富天然植物資源,值得深入（rù）研究它的（de）生物活（huó）性。因此（cǐ）,本研究分析了柳杉精油（yóu）化學成分及其殺白蟻活性,並對精油進行純化、分離、鑒定,從生化水平、蛋白質水（shuǐ）平以（yǐ）及基因水平探討其殺蟲機理；此外,本文初步探討了α-鬆油醇類（lèi）似物化學結構與殺白蟻活性的關係,取得如（rú）下主要結果： 1.柳杉精油化學成分及殺（shā）白蟻活性 為明確柳杉（shān）和日本柳杉精油對白蟻的毒殺（shā）活性（xìng）及化學成（chéng）分特征,采用GC-MS法（fǎ）,比較分析了柳杉和日本柳杉精油的化學成分,並測試（shì）2種精油對黑胸散白蟻的毒殺活性。結果表明,不同種柳杉精油的化學成分存在一定差異（yì）,柳杉精油殺白蟻活性高於日本（běn）柳（liǔ）杉（shān）。 本（běn）文進一步分析了昆（kūn）明、雅安、武漢、恩施、合肥、南京、天目山、福州和廬山等9個國內主要分布（bù）區,不（bú）同季節、樹齡（líng）,以及樹皮、邊材、心材和樹葉4種器官的柳杉精油含（hán）量、化學（xué）成分及其（qí）殺白蟻活性。結果表明,不同產地（dì）、不同季節、樹齡以及柳杉不同（tóng）器（qì）官（guān）精油化（huà）學成分存在（zài）一定差異,但它們（men）的殺蟲活性差異不明顯。同時,柳杉葉精油殺白蟻明顯高於（yú）樹皮（pí）、邊材、心材。因此,柳杉（shān）葉精油可作（zuò）為一種潛在（zài）的天然殺白蟻藥劑。柳杉葉精油成分（fèn）的鑒定與化學品係的（de）分析（xī）,可以了（le）解不同來源的柳杉葉精油組成分的差異與種源地之間的關係。本研（yán）究結果可以為柳杉品係的選育與精油的利用（yòng）或生物活性測定提供參考依（yī）據。 2.柳杉精油有效殺蟲成分的分離與鑒定 為進一步了解柳杉（shān）葉精油中具（jù）有殺白蟻活性成分。采用生物（wù）活性追蹤法,利用矽膠柱層析（xī）,從柳杉葉精油中分離、純化殺白蟻活性物質。通過紅外光（guāng）譜(IR)、質譜（pǔ）(MS)、紫外光譜(UV)、核磁共振(NMR)對柳（liǔ）杉葉精油分離得到的活性（xìng）物質進行解（jiě）析,經鑒定為α-鬆（sōng）油醇,分子式為C10H18O,分子量為（wéi）154.25,為單環單萜醇。α-鬆油醇（chún）對（duì）黑胸散白蟻具有較強的毒性,其毒力回歸方（fāng）程（chéng）為（wéi）Y=0.34+5.05x(R2=0.87),LC50為（wéi）0.86mg/mL。本研究表（biǎo）明,α-鬆（sōng）油醇可作為一種高效、環境（jìng）友好的殺白蟻藥劑。為進一步研究殺蟲機理和化學結構--活性關係奠定基礎（chǔ）,並為（wéi）產業（yè）化開發提（tí）供理論依據。 3.α-鬆油醇對白蟻的殺蟲機理 為探討α-鬆油醇（chún）的殺白蟻作用機理。測定了α-鬆（sōng）油醇對黑胸散白（bái）蟻體（tǐ）內解毒酶和抗氧（yǎng）化酶活性的影響。結果表明,α-鬆油醇對白蟻體內的（de）解毒酶和抗氧化酶的活性均表現出較強的時間效應。LC50劑量(0.86mg/mL)的α-鬆油醇對黑胸散白蟻工蟻體（tǐ）內的乙酰膽堿酯酶(AChE)、鈉鉀ATP酶(Na+-K+-ATPase)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶（méi）(CAT)的酶活性隨處理時間的延（yán）長整體表現（xiàn）出抑製作用；對穀胱甘肽轉移酶(GST)、超氧化（huà）物岐化（huà）酶(SOD)表現誘導增加作（zuò）用。用0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μl/mL劑量的α-鬆油醇處理試蟲後,各劑量的α-鬆油（yóu）醇（chún）均可抑製黑胸散白蟻體內的（de）乙酰膽堿酯酶(AChE)和鈉（nà）鉀ATP酶(Na+-K+-ATPase)的酶活性。白蟻體內的穀胱甘（gān）肽轉（zhuǎn）移酶(GST)、超（chāo）氧化物岐化酶(SOD)、過氧（yǎng）化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)的酶活性隨α-鬆油醇處理劑量的增加而誘導增加。其中,α-鬆油醇對Na+-K+-ATPase具有較強的抑製作用,且隨著中毒症狀的加劇,對該酶的抑製作（zuò）用增（zēng）強。因此（cǐ）,Na+-K+-ATPase可能是α-鬆（sōng）油醇的主要作用靶標。 為了進一步探討α-鬆油醇的（de）作用機理。本文利（lì）用差異蛋白質組學技術,研究α-鬆油醇脅迫下黑胸散白蟻體內蛋白（bái）質的變化,觀察到40個蛋白質發生（shēng）了差異表達（dá）,其中7個（gè）蛋白點為上調表達,24個點為下調表（biǎo）達（dá）,9個蛋白點為在處理後（hòu）新增或消失。質譜分析共鑒定（dìng）出40個蛋白點,包括（kuò）能量代謝、轉運蛋白、細胞骨架蛋白等。這些蛋白（bái）參與了白蟻體（tǐ）內的（de）生理生化過程,表明白蟻在應對（duì）α-鬆油醇（chún）的響應是一個網絡係統。 在α-鬆油醇脅迫下（xià）黑（hēi）胸散白蟻體內（nèi）相關的蛋白質發生表達量的變化（huà）,為更好的了解基（jī）因（yīn）水平的表達差異,本研究應用RT-PCR和RACE技術,克隆得到黑胸散白蟻與能量代謝相關的ATP合成酶(ATP synthase-β-subunit)基因的大部分序列（liè）,從序列的保守性可推知ATP合成酶在不同物種中的功能比較保守。 4.α-鬆油醇類似物殺白蟻活性研究 為研究α-鬆油醇類似物結構（gòu）與殺（shā）白蟻活性的（de）關係,測定了單萜類、醇類、酚類、酮類、醛類、酯類（lèi）和醚類等7個係列42個化合物對白蟻的熏殺效果,結果表明,含氧（yǎng）萜類化合物的殺白蟻活性高於萜類化（huà）合（hé）物；羥基(-OH)基團的位置強於乙酰基：酚類物質結構上（shàng）羥（qiǎng）基(-OH)位置不同,生物活性也不一樣：丙烯基雙鍵的位置對殺白蟻活性很重要：大多數（shù）酮類化合對白蟻的熏殺效（xiào）果都比醇類化合物強,羰基的存在（zài）可能提高了化（huà）合物的毒效。本研（yán）究初步（bù）揭示了（le）單萜（tiē）類化合物的不同化學基團（tuán）對殺白蟻活性的影響,並發（fā）現了大量活性（xìng）明顯高於α-鬆油醇的化合物。 通過本（běn）論文研究,明（míng）確（què）了不同種間、不同產地、不（bú）同季節、不同樹齡及不同器（qì）官柳杉精油化學成分（fèn）存在一定程度的差異,同時,這些（xiē）精油對白蟻都具（jù）有較好毒殺效果,但活性差異不明顯。首次（cì）從（cóng）柳（liǔ）杉葉（yè）精油中分離得到殺（shā）白（bái）蟻活性物質a-鬆油醇,並對它的殺蟲（chóng）機理進行研究,發現α-鬆油醇可抑製黑胸散白蟻體內的解毒酶和誘導氧化酶（méi）係。同時,本文開展了黑胸散白蟻（yǐ）響應α-鬆油醇脅迫的蛋白質（zhì）組學研究,找到了多（duō）個與α-鬆油醇脅迫相關的蛋（dàn）白,揭示了白蟻對α-鬆油醇響應是一個網絡反應。初步揭示了單萜（tiē）類化合物（wù）的不同化學基團對殺白蟻活性的影響。本研究結（jié）果為柳杉精油的應（yīng）用及殺白蟻新藥的研製（zhì）提（tí）供科學依據。

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關鍵詞：

柳杉 精油 化學成分 α-鬆油醇 黑胸散白蟻 殺白蟻活性 殺蟲機理 萜類化合物（wù）